작성자: Brian Wong 및 Dan Fu, 워싱턴 대학교 화학과

요약 

Moku:Pro의 LIA(Lock-in Amplifier)는 SRS(자극 라만 산란) 현미경 실험에서 자가 헤테로다인 신호 감지를 위한 직관적이고 정밀하며 강력한 솔루션을 제공합니다. 고품질 LIA는 변조 전달 감지 방식을 사용하는 SRS 현미경 실험에서 중요한 하드웨어 구성 요소입니다. 이 업데이트된 사례 연구에서는 이중 LIA 애플리케이션의 추가 세부 정보와 설명을 제공합니다.

자극 라만 산란 현미경이란 무엇입니까?

 SRS는 스펙트럼 및 공간 정보를 모두 사용하여 화학적 이미징을 허용하는 일관된 라만 산란 프로세스입니다.¹ 이는 두 개의 동기화된 펄스 레이저, 즉 펌프와 스톡스(그림 1)를 사용하여 분자의 진동을 일관되게 자극합니다. SRS 프로세스는 샘플에 입사된 두 레이저의 주파수 차이가 대상 분자의 진동 주파수와 일치할 때 발생합니다. 진동 여기의 결과로 펌프 빔은 광자를 잃고 스톡스 빔은 광자를 얻습니다. 펌프 빔의 손실이 감지되면 이를 자극 라만 손실(SRL) 감지라고 합니다. 강도 손실 ΔIₚ/Iₚ는 일반적으로 10 정도입니다.^-7-10^-4, 일반적인 레이저 강도 변동보다 훨씬 작습니다. 이러한 문제를 극복하려면 잡음이 많은 배경에서 SRS 신호를 추출하기 위해 고주파 변조 및 위상 감지 감지 방식이 필요합니다.² SRL 감지 방식에서는 스톡스 빔이 고정 주파수에서 변조되고 결과적으로 펌프 빔으로의 변조 전달이 LIA에 의해 감지됩니다.

그림 1: 자극된 라만 손실 감지 방식. SRS로 인해 스톡스의 펌프 빔으로의 진폭 변조 전달이 감지됩니다. 시연된 펌프 빔의 반복률은 80MHz이고 스톡스 빔의 반복률은 동일하지만 80MHz이지만 20MHz로 변조됩니다. Δ펌프는 LIA가 이 감지 체계에서 추출하는 것입니다.

측정기 모델

 활용된 레이저 시스템은 80MHz에서 두 개의 레이저 펄스 열을 출력할 수 있습니다. 스톡스 빔은 1030nm이고 펌프 빔은 790nm입니다. 레이저 출력은 변조를 동기화하는 데에도 사용됩니다. 80MHz 기준은 20MHz TTL 출력을 생성하기 위해 주파수 분배기로 전송됩니다. 이러한 20MHz 출력은 두 번 활용됩니다. 한 번은 Stokes 빔을 변조하기 위한 전기 광학 변조기의 구동 주파수로 사용되고, 다시 한 번은 외부 위상 고정 루프에 대한 LIA의 입력 채널 2(In B)에 대한 기준으로 사용됩니다. 펌프 빔은 실리콘 포토다이오드에 의해 감지되어 LIA의 입력 채널 1(In A)로 전송됩니다. 출력 채널 1(Out A)의 신호는 이미지 획득을 위해 데이터 획득 카드로 전송됩니다. 출력 채널 2(Out B)의 신호가 최소화됩니다(위상 편이 조정을 통해).

단일 채널 잠금 증폭기 구성

그림 2: 일반적인 잠금 증폭기 구성 설정.

그림 2는 SRS 현미경 실험에 사용하기 위한 LIA의 초기 설정을 보여줍니다. 초기 설정 시 위상 고정 루프를 다시 획득해야 합니다. 입력은 모두 AC: 50Ω으로 구성됩니다. 위상 편이(Df)는 Out A가 최대화(양수 값)되고 Out B가 최소화(2913에 가까움)될 때까지 위상 각도를 조정하여 최적화됩니다. 프로브 A는 DMSO의 가장 높은 신호 피크에 해당하는 SRS 신호를 보여줍니다(XNUMX cm^-1) 및 Out A에서 103.3mV 출력으로 최대화됩니다. 프로브 B는 XNUMX으로 최소화되는 직교 출력을 나타냅니다. LIA가 교정 용매에 맞게 최적화되면 샘플을 이미지화할 준비가 됩니다.

그림 3: 2930cm에서의 SRS HeLa 세포 이미지^-1 라만 전환.

그림 3은 Moku:Pro Lock-in Amplifier를 사용하여 촬영한 HeLa 세포의 이미지입니다. 표시된 이미지는 2930cm 라만 이동의 SRS 이미지에서 생성됩니다.^-1, 단백질 피크에 해당합니다. 저역 통과 필터는 ~40μs의 시간 상수에 해당하는 4kHz로 설정됩니다. SRS 신호 크기에 따라 이득이 증가하거나 감소될 수 있습니다.

듀얼 채널 이미징

 Moku:Pro의 LIA는 실시간 2색 SRS 이미징에도 적용할 수 있습니다. 이는 SRS 이미징에 직교 변조를 적용하고 LIA의 X 및 Y 출력을 모두 감지하여 수행됩니다.³ 이 경우 스톡스 변조는 두 부분으로 구성됩니다. 하나는 SRS 신호를 생성하는 20MHz 펄스 트레인이고 다른 하나는 20° 위상 편이를 사용하여 다른 라만 대역을 대상으로 하는 또 다른 SRS 신호를 생성하는 90MHz 펄스 트레인입니다. 90° 위상 변이로 인해 두 채널(Out A 및 Out B)은 서로 직교하며 두 개의 SRS 이미지를 간섭 없이 동시에 획득할 수 있습니다.

2850의 cm^-1 지질 2930cm^-1 단백질

그림 4: 직교 변조 및 출력을 사용하여 두 개의 서로 다른 라만 전이에서 쥐 뇌 샘플의 동시 XNUMX채널 SRS 이미지.

그림 4는 듀얼 채널 X&Y 출력을 활용하여 2930cm에서 두 개의 SRS 이미지를 생성하는 대표적인 이미지입니다.^-1 그리고 2850cm^-1 동시에.

다중 장비 모드 적용

 대부분의 SRS 현미경 실험에서 스펙트럼 범위는 약 300 cm 로 제한됩니다.^-1 레이저의 전체 대역폭이 제한되어 있기 때문입니다. 이러한 기술적 장벽을 우회하는 한 가지 접근 방식은 조정 가능한 레이저를 사용하여 파장을 스캔하는 것입니다. 그러나 파장 튜닝은 느리고 라이브 셀 이미징과 같이 시간에 민감한 실험에는 충분하지 않은 경우가 많습니다. 이 과제에 대한 대안적인 해결책은 다른 라만 전이 영역을 스캔하기 위해 세 번째 레이저 빔을 도입하는 것입니다. 이 기능은 두 개의 스펙트럼 영역(예: 지문 영역(예: ~1600 cm)의 동시 이미징에 특히 매력적입니다.^-1 아미드 진동의 경우) 및 CH 영역의 하나(예: ~2900 cm^-1 단백질의 경우). SRL 이미징 접근 방식에서 실험 설정은 하나의 Stokes 빔과 서로 다른 파장을 가진 두 개의 펌프 빔으로 구성됩니다. 이 설정의 일반적인 감지 방법에는 별도의 감지기와 별도의 LIA가 필요합니다. 그러나 Moku:Pro의 다중 악기 모드에서는 여러 LIA를 배포할 수 있으므로 추가적인 하드웨어 손상 없이 두 번째 LIA를 구현할 수 있습니다.

그림 5: Moku:Pro 다중 계측기 잠금 증폭기 구성.

그림 5는 동시 SRS 현미경 실험을 위한 LIA의 다중 장비 모드 설정을 보여줍니다. 슬롯 1의 경우 In 1은 첫 번째 포토다이오드의 감지된 신호이고 In 2는 기준이며 Out 1은 데이터 수집 카드로 전송된 신호이며 Out 3은 폐기됩니다. 슬롯 2의 경우 In 3은 두 번째 포토다이오드의 감지된 신호이고, In 2는 다시 한번 기준이 되며, Out 2는 데이터 수집 카드로 전송된 신호이고 Out 4는 폐기됩니다. 이 구성은 2개의 Moku 슬롯 중 4개만 사용합니다. 슬롯 3과 4는 할당되지 않았으므로 추가 LIA 또는 기타 Moku 악기에 사용할 수 있습니다. 입력은 모두 AC: 50옴으로 구성됩니다. 각 LIA 슬롯(1 및 2)은 단일 채널 LIA 구성과 동일한 설정을 따릅니다. 데이터 수집 카드로 전송된 각 감지 신호(Out 1 및 2)는 개별 위상 편이를 조정하여 최대화되어야 합니다.

3개의 레이저의 경우 Moku:Pro의 다중 계측기 모드는 2개의 잠금 증폭기로 구성될 수 있어 시스템을 손상 없이 하나의 장치로 단순화할 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 하나의 Moku:Pro를 활용하여 두 개의 포토다이오드 검출기 신호를 처리하여 파수 차이가 큰 두 개의 SRS 이미지를 동시에 촬영할 수 있습니다.

2930의 cm^-1 단백질 2125cm^-1 CD

그림 6: 넓은 간격으로 떨어진 라만 전이에서 다중 기기 설정으로 촬영한 HeLa 셀 SRS 이미지.

그림 6은 두 개의 포토다이오드 검출기 신호를 처리하기 위해 하나의 Moku:Pro를 활용하여 파수 차이가 큰 두 개의 SRS 이미지를 동시에 촬영하는 대표적인 이미지입니다.

결론

 Moku:Pro의 LIA는 다양한 SRS 현미경 실험을 위한 탁월한 솔루션을 제공합니다. 이 문서에서는 일반적인 단일 채널 SRS 이미징, 이중 채널 이미징 및 다중 장비 이미징에 대해 논의했습니다. 사용자 인터페이스를 통해 저강도 ​​SRS 신호 추출을 위한 직관적이고 강력한 제어가 가능합니다. 중요한 것은 Moku:Pro의 다중 장비 도구 기능을 통해 타협 없는 컴팩트 시스템에서 복잡한 이미징 실험이 가능하다는 것입니다.

그림 7: 다중 장비 모드에서 사용 중인 Moku:Pro 이미지. In 1과 In 3은 각각 슬롯 1과 슬롯 2의 LIA에 대한 신호 입력입니다. 2에는 두 LIA 슬롯에 대한 참조가 있습니다. 표시된 구성에서 Out 1과 Out 3은 녹음된 신호이고 Out 2와 Out 4는 슬롯 1과 2에 대한 덤프된 신호입니다.

참조 :

1. 프로디거, W.; 민, W.; 자르, BG; 루, S.; 홀톰, GR; 그, C.; 차이, JC; 강JX; Xie, XS, 자극 라만 산란 현미경을 이용한 고감도 라벨 없는 생의학 이미징. 과학 2008, 322 (5909), 1857-1861.
2. 힐, H.; Fu, D., 자극 라만 산란 현미경을 사용한 세포 이미징. 항문 화학 2019, 91 (15), 9333-9342.
3. 피게로아, ; 후, R.; 레이너, SG; 정, Y.; Fu, D., 자극 라만 산란에 의한 실시간 마이크로규모 온도 이미징. 물리 화학 편지 저널 2020, 11 (17), 7083-7089.