拉曼效应最早由 CV Raman 在 1920 年代发现1，2. 它是一种广泛使用的光谱方法，用于确定分子的振动模式3，4. 与其他分析化学方法相比，光谱方法提供高空间分辨率。 无需直接联系即可获取化学信息。 振动光谱提供合理的化学特异性，无需额外标记。 然而，自发拉曼效应是一个弱散射过程。 对于成像和显微镜应用，获取单个视场可能需要数小时的信号积分时间5。因此，受激拉曼散射效应等相干拉曼散射方法现在被广泛用于拉曼成像。在本应用笔记中，我们将描述如何 Moku:Lab 锁相放大器 在波士顿大学最先进的受激拉曼成像装置中实施。
受激拉曼散射显微镜简介
拉曼光谱 是一种非破坏性分析化学技术。它直接探测样品的振动模式。与电子光谱相比，拉曼光谱（包括受激拉曼光谱）无需荧光标记即可提供高化学特异性。可以以完全无接触和无标签的方式询问样品，从而防止对系统的干扰6,7. 红外 (IR) 光谱是另一种常用的获取振动光谱的方法。 红外和拉曼光谱的选择规则不同； 红外光谱对偶极子的变化很敏感，而拉曼对极化率的变化很敏感4这使得红外光谱和拉曼光谱成为研究特定化学键的有效工具。对于成像和显微应用，在选择红外光谱或拉曼光谱时，还有两个重要因素需要考虑：1）空间分辨率要求。红外光谱使用红外光作为光源。拉曼光谱可以使用可见光或近红外（NIR）激光进行激发。由于可见光或近红外激光的波长更短，拉曼显微镜的空间分辨率可以达到亚微米级。另一方面，红外光的波长为几微米。对于许多显微应用而言，其空间分辨率较差。2）水在红外区域具有很强的吸收。对于富含水的环境（例如生物样品），红外光谱可能会受到强烈的背景吸收。因此，在某些情况下，拉曼光谱是更优的选择。与占主导地位的瑞利散射相比，拉曼散射非常弱。通常需要几秒钟的较长积分时间才能获得合理的信噪比。对于常规光谱学而言，这或许不是问题，但对于光谱成像而言，获取单个视场可能需要数小时。为了增强信号，多年来人们开发了多种不同的方法。基于等离子体激元的方法，例如表面增强拉曼光谱，进一步将检测限降低到单分子水平。8. 相反，纳米粒子引起的不均匀性使得成像变得困难。 对于成像科学家来说，更有前途的方法是非线性光学增强的相干拉曼散射方法：受激拉曼散射 (SRS) 和相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS)。
数字 1: Moku:Lab 波形发生器产生的 10 MHz FM 信号
相干拉曼效应于 1960 年代首次被发现6. 在 1990 世纪 2000 年代后期和 XNUMX 年代，由于超快锁模激光器的进步，Sunney Xie 及其同事率先使用了 CARS9 和SRS10 用于无标记化学显微镜。 从那时起，这些技术被广泛应用于化学、生物学和材料科学研究6,7,11。 CARS 和受激拉曼散射有很多相似之处；这些非线性光学过程通常发生在相同的条件下，并且仪器设置几乎相同。然而，也有一些差异；就像自发拉曼一样，CARS 信号（图 1，ωas 反斯托克斯）与入射激光束（ωp, 泵, ωs 斯托克斯）。 使用短通滤波器很容易将信号与入射光分开。 到达检测器的光子总量很少，使用更灵敏的光子检测器，如光电倍增管 (PMT) 进行检测。 然而，CARS 受到其他非共振非线性光学效应产生的背景的影响。 这些影响不仅限制了 CARS 测量的实际检测极限，而且还扭曲了光谱（与分子振动共振相比）。 另一方面，SRS 信号不受大多数其他非线性光学效应的干扰。 然而，SRS 是一个受激发射过程。 信号出现在与入射光相同的波长处。 SRS 效应仅分别略微增加/减少斯托克斯和泵浦光束的光子数量。 这些变化非常小，无法通过常规时域测量方法进行测量。 因此，SRS 需要具有锁定检测的光学泵浦探测技术。光泵浦探测技术和锁定检测
泵浦探针方法是受激拉曼散射显微镜中广泛采用的检测多光子过程的方法。该实验通常涉及两束超快（皮秒或飞秒）激光束。一束光束始终照亮样品，而第二束光束以恒定频率进行 AM 调制。因此，由第二光束引起的任何变化或扰动都会以调制频率转移到第一光束。在探测器上，光学滤波器用于阻挡调制光束。仅检测未调制的波长。由于信号仅出现在调制频率附近，因此通常使用锁定放大器 (LIA) 来放大信号。锁定放大器使用零差检测方法，将输入信号与调制频率的正弦本地振荡器混合。然后，它通过低通滤波器和电压放大器（可选）发送信号，并输出到数字化仪或示波器。这确保了只有非常接近调制频率的信号才会被放大和检测。其他频率（例如激光重复频率或直流背景）的信号将被拒绝。这使得锁相放大器成为泵浦探针检测的重要工具。有关锁定放大器的更详细说明可以在以下视频中找到： https://youtu.be/H2O2ADqEkHM 和 https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg对于受激拉曼散射，泵浦光和斯托克斯光两束光的能量差经过精确调谐，使其与目标拉曼频移完全匹配。理论上，可以调制泵浦光或斯托克斯光，另一束光用于探测。如果调制泵浦光，受激拉曼散射（SRS）过程会在泵浦光开启时使斯托克斯光略微增强。在探测器处，泵浦光被阻挡，只探测到斯托克斯光。这称为受激拉曼增益（SRG）探测。如果调制斯托克斯光，SRS过程会在斯托克斯光开启时使泵浦光略微减弱。在探测器处，斯托克斯光被阻挡，只探测到泵浦光。这称为受激拉曼损耗（SRL）探测。在本应用笔记的示例用例中，由于光电探测器针对泵浦波长进行了优化，因此采用了SRL方案。
图2： SRS 显微镜的 SRL 和 SRG 检测
使用 Moku:Lab 进行受激拉曼散射实验设置
激光
受激拉曼散射的产生需要两个超快激光脉冲在空间和时间上重叠在样品上。为了获得稳定的时间重叠，当今的 SRS 显微镜通常使用单个钛蓝宝石激光器来产生泵浦光束和斯托克斯光束。皮秒和飞秒激光器均可用于 SRS 测量。皮秒激光器提供更精细的光谱分布。无需额外的光学器件即可实现高光谱分辨率。与自发拉曼不同，自发拉曼可以用单色激光同时测量所有拉曼位移，受激拉曼需要调谐波长来测量额外的光谱点，而调谐激光波长会限制采集光谱图像时的测量速率。另一方面，飞秒激光器本身具有广谱。一种称为“光谱聚焦”的技术可用于快速调整泵浦和斯托克斯光束之间的能量差。可以在更短的时间内获取光谱图像。然而，这种方法也显着增加了系统的光学复杂性。光路中需要添加一对衍射光栅或高折射率材料（如SF57玻璃棒），光谱范围受到限制。关于光谱聚焦方法的详细解释可以在最近的出版物中找到12简而言之，如果一次只关注一个拉曼位移，皮秒激光器的设置要简单得多。飞秒激光器更适合快速高光谱图像采集，但系统复杂度较高。Moku:Lab LIA 可以与皮秒激光器和飞秒激光器配合使用。在本应用笔记中介绍的用例中，我们使用了一台飞秒激光器（Spectra-physics Mai Tai）以及用于光谱聚焦的 SF57 玻璃棒。调制、延迟级和扫描头
泵浦光束和斯托克斯光束通常由声光调制器 (AOM) 或电光调制器 (EOM) 进行调制。调制频率通常在兆赫兹 (MHz) 范围内。这有助于降低光热膨胀产生的背景噪声，并提高图像采集速度。在本应用笔记中，泵浦光束由 AOM 以约 2 MHz 的频率进行调制。为了在时间上对准泵浦光束和斯托克斯光束，使用电动延迟台来调节其中一个或两个光束的光程。对于具有光谱聚焦的飞秒 SRS，延迟台还用于微调泵浦光束和斯托克斯光束之间的能量差。与大多数其他非线性光学显微镜一样，CARS 和 SRS 图像采集通常采用光束扫描方法。一对振镜-振镜或振镜-谐振扫描头放置在物镜之前。在本例中，使用了一对振镜（GVS 102，Thorlabs）。物镜/聚光镜、检测器和数据采集
扫描头之后，光束被引导至物镜，在样品上形成一个聚焦光点。为了建立相干拉曼散射的相位匹配条件，优选使用高数值孔径（NA）的水浸或油浸物镜。光线沿前向收集并重新聚焦到光电探测器上。为确保收集效率，建议使用油浸物镜。在本实验中，使用了60倍、1.2 NA的水浸物镜（UPLSASP 60XW，奥林巴斯）。光线经聚光镜收集后，经过一个光学滤波器（用于阻挡调制光束）后重新聚焦到光电二极管上。光电二极管的信号随后被送至锁相放大器（根据光电二极管的配置，可能需要前置放大器/跨阻放大器）。锁相放大器将信号与本振信号混频，并将调制频率的交流信号转换为直流输出。然后，信号被送至数据采集系统以形成图像。在本应用中，使用滨松S3994-01单片机和自制的跨阻放大器来检测光滤波器后的残余光。信号随后被送至Moku:Lab的LIA进行交流信号放大和转换。输入信号采用外部锁相环（PLL）模式进行解调。7 μs，2nd 混频器后采用10阶低通滤波器。解调信号经XNUMX dB增益后送至模拟输出。激光干涉仪（LIA）的输出经NI DAQ系统数字化，图像由自制NI虚拟仪器生成。
图3： 带 Moku:Lab LIA 的 SRS 显微镜
结果与讨论
为了测试 Moku:Lab LIA 性能，将一滴二甲基亚砜 (DMSO) 夹在两个盖玻片之间。然后通过受激拉曼散射显微镜对液滴的边缘进行成像。激光在扫描头之前使用 798 nm 泵浦 (30 mW) 和 1040 nm Stokes (150 mW) 进行调谐。在整个光谱范围内总共采集了 100 张图像。 LIA 的时间常数设置为 7 μs。图 4 显示了液滴边缘的 XY 剖面，右侧绘制了 Z 剖面（拉曼光谱）。可以清楚地观察到由CH键振动共振引起的两个主峰。
图4： DMSO 液滴的高光谱 SRS 图像
要访问图像的信噪比 (SNR)，最亮的图像（接近 2930 cm-1） 用来。 SNR 是通过液滴区域中 10 x 10 框的平均强度超过背景区域中 10 x 10 框的标准偏差来计算的。 观察到 SNR 为 1100。承认
我们要感谢波士顿大学的 Ji-Xin Cheng、Peng Lin 和 Haonan Lin 教授向我们提供了他们的实验细节、Moku:Lab 的使用说明和反馈。案例
- 拉曼，CV (1922)。 光的分子散射。 加尔各答大学。
- 拉曼，CV (1928)。 一种新的辐射。
- DA 龙 (1977)。 拉曼光谱。 纽约，1-12。
- Colthup, N. (2012)。 介绍红外和拉曼光谱。 爱思唯尔。
- Zhang, S., Song, Z., Godaliyadda, GDP, Ye, DH, Chowdhury, AU, Sengupta, A., … & Simpson, GJ (2018)。 共焦拉曼显微镜的动态稀疏采样。 分析化学90（7），4461 4469。
- Prince, RC, Frontiera, RR 和 Potma, EO (2017)。 受激拉曼散射：从体积到纳米。 化学评论117（7），5070 5094。
- Zhang, C., & Cheng, JX (2018)。 透视：相干拉曼散射显微镜，前途一片光明。 APL光电，3（9），090901。
- Nie, S., & Emory, SR (1997)。 通过表面增强拉曼探测单分子和单纳米粒子 散射。 科学，275(5303)，1102-1106。
- Zumbusch, A., Holtom, GR, & Xie, XS (1999)。 相干反斯托克斯拉曼散射的三维振动成像。 物理评论信，82（20），4142。
- Freudiger, CW, Min, W., Saar, BG, Lu, S., Holtom, GR, He, C., … & Xie, XS (2008)。 通过受激拉曼散射显微镜进行高灵敏度的无标记生物医学成像。 科学322（5909），1857 1861。
- Cheng, JX, & Xie, XS（编辑）。 (2016)。 相干拉曼散射显微镜。 CRC出版社。
- Liao, CS, Huang, KC, Hong, W., Chen, AJ, Karanja, C., Wang, P., … & Cheng, JX (2016)。 通过微秒延迟线调谐受激拉曼光谱成像。 。光学3（12），1377 1380。