자극 라만 산란 현미경

유도 라만 산란 현미경 검사를 위한 Moku:Lab Lock-in Amplifier 사용

2020 년 9 월 4 일

라만 효과는 1920년대 CV Raman에 의해 처음 발견되었습니다.^{1, 2}. 분자의 진동 모드를 결정하기 위해 널리 사용되는 분광학 방법입니다.^{3, 4}. 다른 분석 화학 방법과 비교하여 분광학 접근법은 높은 공간 분해능을 제공합니다. 화학 정보를 얻기 위해 직접 연락할 필요는 없습니다. 진동 스펙트럼은 추가 라벨이 필요 없이 합리적인 화학적 특이성을 제공합니다. 그러나 자발적인 라만 효과는 약한 산란 과정입니다. 이미징 및 현미경 응용 분야의 경우 단일 시야를 확보하는 데 몇 시간의 신호 통합 시간이 걸릴 수 있습니다.⁵. 따라서 자극 라만 산란 효과와 같은 일관성 있는 라만 산란 방법이 현재 라만 이미징에 널리 사용됩니다. 이번 애플리케이션 노트에서는 Moku:Lab 락인 증폭기 보스턴 대학의 최첨단 자극 라만 이미징 설정에서 구현되었습니다.

유도 라만 산란 현미경 소개

라만 분광학 비파괴 분석 화학 기술입니다. 샘플의 진동 모드를 직접 조사합니다. 전자 분광법에 비해 유도 라만 분광법을 포함한 라만 분광법은 형광 라벨이 필요 없이 높은 화학적 특이성을 제공합니다. 완전히 비접촉식, 라벨 없는 방식으로 시료를 조사할 수 있어 시스템에 대한 교란을 방지할 수 있습니다.^6,7. 적외선(IR) 분광학은 진동 스펙트럼을 얻기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 방법입니다. IR 및 Raman 분광법의 선택 규칙은 다릅니다. IR 분광법은 쌍극자의 변화에 민감하고 Raman은 분극도의 변화에 민감합니다.⁴. 이로 인해 IR과 Raman은 특정 화학 결합 세트에 적합한 도구가 됩니다. 이미징 및 현미경 응용 분야의 경우 IR 또는 Raman 분광학 중에서 선택할 때 고려해야 할 두 가지 중요한 요소가 있습니다. 1) 공간 분해능 요구 사항. IR 분광법은 IR 빛을 광원으로 사용합니다. Raman은 여기를 위해 가시광선 또는 근적외선(NIR) 레이저를 사용할 수 있습니다. 가시광선 또는 NIR 레이저는 파장이 훨씬 짧기 때문에 라만 현미경의 공간 분해능은 서브미크론 범위에 도달할 수 있습니다. 반면 IR 광선은 수 마이크론의 파장을 갖습니다. 많은 현미경 응용 분야에서는 공간 분해능이 좋지 않은 것으로 간주됩니다. 2) 물은 IR 영역에서 강한 흡수력을 가지고 있습니다. 물이 풍부한 환경(예: 생물학적 샘플)의 경우 IR은 강한 배경 흡수로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 어떤 경우에는 Raman이 선호됩니다.

라만 산란은 우성 레일리 산란에 비해 매우 약합니다. 합리적인 신호 대 잡음비를 얻으려면 일반적으로 몇 초의 긴 통합 시간이 필요합니다. 이는 일반 분광학에서는 문제가 되지 않을 수 있지만 분광학 이미징의 경우 단일 시야를 얻는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 신호를 향상시키기 위해 수년에 걸쳐 여러 가지 다른 접근 방식이 개발되었습니다. 표면 강화 라만 분광법과 같은 플라즈몬 기반 방법은 검출 한계를 단일 분자 수준으로 더욱 줄입니다.⁸. 대조적으로, 나노입자의 유도된 불균질성은 이미징을 어렵게 만듭니다. 영상 과학자들에게 더 유망한 접근 방식은 비선형 광학 강화 응집성 라만 산란 방법인 자극 라만 산란(SRS) 및 응집성 반스토크스 라만 산란(CARS)입니다.

그림 1: Moku:Lab의 파형 발생기로 생성된 10MHz의 FM 신호

응집성 라만 효과는 1960년대에 처음 발견되었습니다.⁶. 1990년대 후반과 2000년대 초고속 모드 잠금 레이저의 발전 덕분에 Sunney Xie와 동료들은 CARS 사용을 개척했습니다.⁹ 그리고 SRS¹⁰ 라벨이 없는 화학현미경을 위한 제품입니다. 그 이후로 이러한 기술은 화학, 생물학 및 재료 과학 연구에서 널리 사용되었습니다.^6,7,11. CARS와 유도 라만 산란에는 많은 유사점이 있습니다. 이러한 비선형 광학 프로세스는 일반적으로 동일한 조건에서 발생하며 기기 설정은 거의 동일합니다. 그러나 몇 가지 차이점이 있습니다. 자발적인 라만과 마찬가지로 CARS 신호(그림 1, Ω_as반스토크스)는 들어오는 레이저 빔(Ω)과 다른 파장에서 발생합니다._p, 펌프, Ω_s 스톡스). 단거리 통과 필터를 사용하면 입사광에서 신호를 쉽게 분리할 수 있습니다. 검출기에 도달하는 광자의 총량은 적으며, 검출을 위해 광전자 증배관(PMT)과 같은 보다 민감한 광자 검출기가 사용됩니다. 그러나 CARS는 다른 비공진 비선형 광학 효과로 인해 생성되는 배경으로 인해 어려움을 겪습니다. 이러한 효과는 CARS 측정에 대한 실질적인 검출 한계를 제한할 뿐만 아니라 스펙트럼을 왜곡합니다(분자 진동 공명과 비교하여). 반면, SRS 신호는 대부분의 다른 비선형 광학 효과에 의해 간섭을 받지 않습니다. 그러나 SRS는 유도 방출 과정입니다. 신호는 입사광과 동일한 파장에서 발생합니다. SRS 효과는 스톡스 빔과 펌프 빔의 광자 수를 각각 약간만 증가/감소시킵니다. 변화가 너무 작아서 일반적인 시간 영역 측정 방법으로는 측정할 수 없습니다. 따라서 SRS에는 잠금 감지 기능을 갖춘 광학 펌프 프로브 기술이 필요합니다.

광학 펌프-프로브 기술 및 잠금 감지

펌프-프로브 방법은 유도 라만 산란 현미경 검사법에서 다중 광자 과정을 검출하기 위해 널리 채택되는 방법입니다. 실험에는 일반적으로 두 개의 초고속(피코초 또는 펨토초) 레이저 빔이 사용됩니다. 하나의 빔은 항상 샘플을 비추고, 두 번째 빔은 일정한 주파수에서 AM 변조됩니다. 따라서 두 번째 빔에 의해 유발된 모든 변화 또는 교란은 변조 주파수의 첫 번째 빔으로 전달됩니다. 검출기에서는 변조된 빔을 차단하기 위해 광학 필터가 사용됩니다. 변조되지 않은 파장만 감지됩니다. 신호는 변조 주파수 근처에서만 발생하므로 일반적으로 LIA(Lock-in Amplifier)가 신호를 증폭하는 데 사용됩니다. 락인 증폭기는 호모다인 감지 방법을 사용하여 변조 주파수에서 수신 신호를 정현파 국부 발진기와 혼합합니다. 그런 다음 저역 통과 필터와 전압 증폭기(옵션)를 통해 신호를 보내고 디지타이저나 오실로스코프에 출력합니다. 이렇게 하면 변조 주파수에 매우 가까운 신호만 증폭되고 감지됩니다. 다른 주파수(예: 레이저 반복 주파수 또는 DC 배경)의 신호는 거부됩니다. 이로 인해 잠금 증폭기는 펌프 프로브 감지를 위한 필수 도구가 됩니다. 잠금 증폭기에 대한 자세한 설명은 다음 비디오에서 확인할 수 있습니다. https://youtu.be/H2O2ADqEkHM 와 https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg.

특히 유도 라만 산란의 경우 두 개의 빔(펌프 및 스톡스)은 관심 있는 라만 이동과 정확하게 일치하는 에너지 차이로 조정됩니다. 이론적으로 펌프 또는 스톡스 빔은 다른 빔이 감지에 사용되는 곳에서 변조될 수 있습니다. 펌프 빔이 변조되면 SRS 프로세스는 펌프 빔이 켜진 상태에서 스톡스 빔의 약간의 증가를 유도합니다. 검출기에서는 펌프빔은 차단되고 스톡스빔만 검출됩니다. 이를 자극 라만 이득(SRG) 검출이라고 합니다. 스톡스 빔이 변조되면 SRS 프로세스는 스톡스 빔이 켜진 상태에서 펌프 빔의 약간의 감소를 유도합니다. 검출기에서는 스톡스빔은 차단되고 펌프빔만 검출됩니다. 이를 자극 라만 손실(SRL) 감지라고 합니다. 이 애플리케이션 노트에 제시된 사용 사례의 경우, 광검출기가 펌프 파장에 최적화되어 있으므로 SRL 체계가 구현됩니다.

그림 2 : SRS 현미경을 위한 SRL 및 SRG 감지

Moku:Lab을 이용한 자극 라만 산란 실험 설정

레이저

자극된 라만 산란을 생성하려면 공간적으로나 시간적으로 샘플에 겹치는 두 개의 초고속 레이저 펄스가 필요합니다. 안정적인 시간적 중첩을 얻기 위해 오늘날의 SRS 현미경은 일반적으로 단일 Ti:Sapphire 레이저를 사용하여 펌프와 스톡스 빔을 모두 생성합니다. SRS 측정에는 피코초 레이저와 펨토초 레이저를 모두 사용할 수 있습니다. 피코초 레이저는 더 미세한 스펙트럼 프로파일을 제공합니다. 추가 광학 장치 없이도 높은 스펙트럼 분해능을 얻을 수 있습니다. 모든 라만 이동을 단색 레이저로 동시에 측정할 수 있는 자연 라만과 달리 자극 라만은 추가 스펙트럼 지점을 측정하기 위해 파장 조정이 필요하며, 레이저 파장 조정은 분광 이미지를 획득할 때 측정 속도를 제한합니다. 반면, 펨토초 레이저는 기본적으로 넓은 스펙트럼을 가지고 있습니다. "스펙트럼 포커싱"이라는 기술을 사용하여 펌프와 스톡스 빔 사이의 에너지 차이를 신속하게 조정할 수 있습니다. 훨씬 짧은 시간 내에 분광 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이 방법은 시스템의 광학적 복잡성도 크게 증가시킵니다. 한 쌍의 회절 격자 또는 고굴절률 재료(예: SF57 유리 막대)를 빔 경로에 추가해야 하며 스펙트럼 범위가 제한됩니다. 스펙트럼 포커싱 방법에 대한 자세한 설명은 최근 간행물에서 찾을 수 있습니다.¹².

간단히 말해서, 한 번에 단일 라만 시프트에 관심이 있는 경우 피코초 레이저를 설정하는 것이 훨씬 간단합니다. 시스템이 복잡해지는 대신 빠른 초분광 이미지 획득을 위해서는 펨토초 레이저가 선호됩니다. Moku:Lab LIA는 피코초 및 펨토초 레이저와 함께 사용할 수 있습니다. 이 애플리케이션 노트에 제시된 사용 사례에서는 스펙트럼 포커싱을 위해 SF57 유리 막대와 함께 펨토초 레이저(Spectra-physics Mai Tai)가 사용되었습니다.

변조, 지연 단계 및 스캔 헤드

펌프와 스톡스 빔은 일반적으로 음향광학 변조기(AOM) 또는 전기광학 변조기(EOM)에 의해 변조됩니다. 변조 주파수는 일반적으로 MHz 범위입니다. 이는 광열 팽창으로 인해 생성되는 배경을 줄이고 이미지 획득 속도를 높이는 데 도움이 됩니다. 이 애플리케이션 노트에서 펌프 빔은 약 2MHz에서 AOM에 의해 변조되었습니다.

펌프와 스톡스 빔을 일시적으로 정렬하기 위해 전동식 지연 스테이지를 사용하여 빔 경로 중 하나 또는 둘 다의 경로 길이를 조정합니다. 스펙트럼 포커싱을 갖춘 펨토초 SRS의 경우 지연 단계는 펌프와 스톡스 빔 간의 에너지 차이를 미세 조정하는 데에도 사용됩니다.

대부분의 다른 비선형 광학 현미경과 마찬가지로 빔 스캐닝 방법은 일반적으로 CARS 및 SRS 이미지 획득에 사용됩니다. 한 쌍의 갈보 갈보 또는 갈보 공진 스캔 헤드가 대물렌즈 앞에 배치됩니다. 제시된 사례에서는 한 쌍의 갈보 거울(GVS 102, Thorlabs)이 사용되었습니다.

대물렌즈/응축기, 검출기 및 데이터 수집

스캔 헤드 이후 빔은 대물렌즈로 향하여 샘플에 단단히 초점이 맞춰진 지점을 형성합니다. 일관된 라만 산란을 위한 위상 일치 조건을 설정하려면 높은 개구수(NA) 물 또는 오일 침지 대물렌즈가 선호됩니다. 그런 다음 빛은 전방 방향으로 수집되어 광검출기에 다시 초점을 맞춥니다. 수집 효율성을 보장하려면 오일 침지 대물렌즈를 권장합니다. 제시된 경우에는 60X 1.2 NA 수침 대물렌즈(UPLSASP 60XW, Olympus)가 사용되었습니다.

집광기에 의해 빛이 수집되면 광학 필터 뒤의 포토다이오드로 초점이 다시 맞춰져 변조 빔을 차단합니다. 그런 다음 포토다이오드의 신호는 락인 증폭기로 전송됩니다(포토다이오드 구성에 따라 프리앰프/트랜스임피던스 증폭기가 필요할 수 있음). 잠금 증폭기는 신호를 국부 발진기와 혼합하고 변조 주파수의 AC 신호를 DC 출력으로 변환합니다. 그런 다음 데이터 수집 시스템으로 전송되어 이미지를 형성합니다. 이 애플리케이션에서는 집에서 만든 트랜스임피던스 증폭기와 쌍을 이루는 Hamamatsu S3994-01을 사용하여 광학 필터 뒤에 남은 빛을 감지했습니다. 그런 다음 신호는 AC 신호 증폭 및 대화를 위해 Moku:Lab의 LIA로 전송되었습니다. 입력은 외부(PLL) 모드로 복조되었습니다. 7μs, 2^nd 믹서 이후에 저역 통과 필터를 사용했습니다. 그런 다음 복조된 신호는 10dB 이득 이후 아날로그 출력으로 전송되었습니다. LIA의 출력은 NI DAQ 시스템으로 디지털화되었으며, 이미지는 집에서 만든 NI 버추얼 인스트루먼트로 생성되었습니다.

그림 3 : Moku:Lab LIA가 포함된 SRS 현미경

결과 및 논의

Moku:Lab LIA 성능을 테스트하기 위해 DMSO(디메틸 설폭사이드) 방울을 두 커버슬립 사이에 끼웠습니다. 그런 다음 자극 라만 산란 현미경을 사용하여 액적의 가장자리를 이미지화했습니다. 레이저는 스캔 헤드 전에 798 nm 펌프(30 mW) 및 1040 nm Stokes(150 mW)로 조정되었습니다. 전체 스펙트럼 범위에 걸쳐 총 100개의 이미지가 획득되었습니다. LIA의 시정수는 7μs로 설정되었습니다. 그림 4는 액적 가장자리의 XY 프로파일을 보여주며 오른쪽에는 Z 프로파일(라만 스펙트럼)이 표시되어 있습니다. CH 결합 진동 공명에 의해 유도된 두 가지 주요 피크를 명확하게 관찰할 수 있습니다.

그림 4 : DMSO 액적의 초분광 SRS 이미지

이미지의 신호 대 잡음비(SNR)에 액세스하려면 가장 밝은 이미지(2930cm 근처)^-1) 사용. SNR은 배경 영역의 10 x 10 상자 표준 편차에 대한 액적 영역의 10 x 10 상자의 평균 강도로 계산되었습니다. 1100의 SNR이 관찰되었습니다.

승인

실험의 세부 사항, Moku:Lab 사용에 대한 설명 및 피드백을 제공한 Boston University의 Ji-Xin Cheng, Peng Lin 및 Haonan Lin 교수에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다.

참고자료

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