ワシントン大学化学科、Brian Wong および Dan Fu による寄稿

まとめ 

Moku:Pro のロックイン アンプ (LIA) は、誘導ラマン散乱 (SRS) 顕微鏡実験における自己ヘテロダイン信号検出のための直感的で正確かつ堅牢なソリューションを提供します。高品質の LIA は、変調伝達検出方式を使用した SRS 顕微鏡実験において重要なハードウェア コンポーネントです。この更新されたケーススタディでは、デュアル LIA アプリケーションの詳細と説明を提供します。

誘導ラマン散乱顕微鏡とは何ですか?

 SRS は、スペクトル情報と空間情報の両方による化学イメージングを可能にするコヒーレント ラマン散乱プロセスです。¹ これは、1 つの同期パルスレーザー、つまりポンプレーザーとストークスレーザー (図 10) を使用して、分子の振動をコヒーレントに励起します。 SRS プロセスは、サンプルに入射する XNUMX つのレーザーの周波数差がターゲット分子の振動周波数と一致するときに発生します。振動励起の結果、ポンプ ビームは光子を失い、ストークス ビームは光子を獲得します。ポンプビームの損失が検出されることを、誘導ラマン損失 (SRL) 検出と呼びます。強度損失 ΔIₚ/Iₚ は通常 XNUMX 程度です。^-7-10^-4、一般的なレーザー強度の変動よりもはるかに小さいです。この課題を克服するには、ノイズの多い背景から SRS 信号を抽出するために、高周波変調と位相敏感検出方式が必要です。² SRL 検出方式では、ストークス ビームは固定周波数で変調され、その結果生じるポンプ ビームへの変調伝達が LIA によって検出されます。

図 1: 誘導ラマン損失の検出スキーム。 SRS によるポンプ ビームへのストークスの振幅変調伝達が検出されます。実証されたポンプ ビームの繰り返し率は 80 MHz で、ストークス ビームも同じ 80 MHz の繰り返しですが、20 MHz で変調されています。 Δポンプは、LIA がこの検出スキームで抽出するものです。

セットアップ

 使用されたレーザー システムは、80 MHz で 1030 つのレーザー パルス列を出力できます。ストークス ビームは 790 nm、ポンプ ビームは 80 nm です。レーザー出力は変調の同期にも使用されます。20 MHz の基準が分周器に送信されて、20 MHz TTL 出力が生成されます。これらの 2 MHz 出力は 1 回利用されます。1 回目はストークス ビームを変調するための電気光学変調器の駆動周波数として、もう 2 回目は外部フェーズ ロック ループ用の LIA の入力チャネル XNUMX (In B) への基準として使用されます。ポンプビームはシリコンフォトダイオードによって検出され、LIA の入力チャネル XNUMX (In A) に送信されます。出力チャンネル XNUMX (Out A) からの信号は、画像取得のためにデータ取得カードに送信されます。出力チャンネル XNUMX (Out B) からの信号は、(位相シフトを調整することにより) 最小化されます。

シングルチャンネルロックインアンプ構成

図 2: 一般的なロックイン アンプの構成設定。

図 2 は、SRS 顕微鏡実験で使用する LIA の初期設定を示しています。初期設定時に、位相ロック ループを再取得する必要があります。入力は両方とも AC: 50 オームに設定されています。位相シフト (Df) は、Out A が最大化 (正の値)、Out B が最小化 (ゼロに近づく) まで位相度を調整することによって最適化されます。プローブ A は、DMSO の最も高い信号ピーク (2913 cmXNUMX) に対応する SRS 信号を示します。^-1）、出力 A から 103.3 mV を出力するように最大化されます。プローブ B は、ゼロに最小化される直交出力を示します。 LIA がキャリブレーション溶媒に対して最適化されると、サンプルをイメージングする準備が整います。

図 3: 2930 cm での SRS HeLa 細胞画像^-1 ラマン転移。

図 3 は、Moku:Pro Lock-in Amplifier を使用して撮影された HeLa 細胞の画像です。表示されている画像は、ラマン シフト 2930 cm の SRS 画像から生成されています。^-1、タンパク質のピークに対応します。ローパス フィルターは 40 kHz に設定されており、時定数は約 4 μs に相当します。ゲインは、SRS 信号のサイズに応じて増減できます。

デュアルチャンネルイメージング

 Moku:Pro の LIA は、リアルタイム 2 色 SRS イメージングにも適応できます。これは、SRS イメージングに直交変調を適用し、LIA の X 出力と Y 出力の両方を検出することによって実行されます。³ この場合、ストークス変調には 20 つの部分があります。20 つは SRS 信号を生成する 90 MHz パルス列で、もう 90 つは XNUMX° 位相シフトを持つ XNUMX MHz パルス列で、異なるラマン帯域を対象とする別の SRS 信号を生成します。 XNUMX°の位相シフトにより、XNUMX つのチャネル (Out A と Out B) は互いに直交し、干渉することなく XNUMX つの SRS 画像を同時に取得できます。

2850 cm^-1 脂質 2930cm^-1 タンパク質

図 4: 直交変調と出力を使用した XNUMX つの異なるラマン遷移におけるマウス脳サンプルの同時 XNUMX チャネル SRS 画像。

図 4 は、デュアル チャネル X&Y 出力を利用して 2930 cm で XNUMX つの SRS 画像を生成した代表的な画像です。^-1 と2850センチ^-1 同時に。

マルチインストゥルメントモードアプリケーション

 ほとんどの SRS 顕微鏡実験では、スペクトル範囲は約 300 cm に制限されています。^-1 レーザーの合計帯域幅には制限があるためです。この技術的障壁を回避する 1600 つのアプローチは、波長可変レーザーで波長をスキャンすることです。ただし、波長調整は遅く、生細胞イメージングなどの時間に敏感な実験には不十分なことがよくあります。この課題に対する代替の解決策は、異なるラマン遷移領域を走査するために XNUMX 番目のレーザー ビームを導入することです。この機能は、XNUMX つのスペクトル領域を同時にイメージングする場合に特に魅力的です。XNUMX つは指紋領域 (例: ~XNUMX cm)^-1 アミド振動用）と CH 領域に 2900 つ（例: ~XNUMX cm）^-1 プロテイン用）。 SRL イメージング手法では、実験セットアップは 1 つのストークス ビームと、異なる波長の 2 つのポンプ ビームで構成されます。このセットアップの通常の検出方法では、別個の検出器と別個の LIA が必要です。ただし、Moku:Pro のマルチ機器モードでは複数の LIA の導入が可能であるため、追加のハードウェアの妥協を必要とせずに 2 番目の LIA を実装できます。

図 5: Moku:Pro マルチ楽器ロックインアンプ構成。

図 5 は、同時 SRS 顕微鏡実験用の LIA のマルチ機器モード設定を示しています。スロット 1 の場合、In 1 は最初のフォトダイオードの検出信号、In 2 は基準、Out 1 はデータ収集カードに送信される信号、Out 3 は破棄されます。スロット 2 の場合、In 3 は 2 番目のフォトダイオードの検出信号、In 2 は再び基準、Out 4 はデータ収集カードに送信される信号、Out 2 は破棄されます。この構成では、4 つの Moku スロットのうち 3 つだけを使用します。スロット 4 と 50 は割り当てられていないため、追加の LIA またはその他の Moku 機器に使用できます。入力はすべて AC: 1 オームに設定されています。各 LIA スロット (2 および 1) は、シングル チャネル LIA 構成と同じセットアップに従います。データ収集カードに送信される各検出信号 (出力 2 および出力 XNUMX) は、それぞれの位相シフトを調整して最大化する必要があります。

3 つのレーザーの場合、Moku:Pro のマルチ機器モードは 2 つのロックインアンプで構成でき、妥協することなくシステムを 1 つのデバイスにまで簡素化できます。これにより、研究者は、1 つの Moku:Pro を利用して 2 つのフォトダイオード検出器信号を処理し、大きな波数差の 2 つの SRS 画像を同時に撮影することができます。

2930 cm^-1 タンパク質 2125cm^-1 CD

図 6: 複数の機器をセットアップして、間隔の広いラマン遷移で撮影された HeLa 細胞の SRS 画像。

図 6 は、XNUMX つの Moku:Pro を使用して XNUMX つのフォトダイオード検出器信号を処理して、大きな波数差の XNUMX つの SRS 画像を同時に撮影した代表的な画像です。

まとめ

 Moku:Pro の LIA は、多数の SRS 顕微鏡実験に優れたソリューションを提供します。この文書では、典型的なシングル チャネル SRS イメージング、デュアル チャネル イメージング、およびマルチ機器イメージングについて説明しました。ユーザー インターフェイスにより、低強度の SRS 信号を抽出するための直感的かつ強力なコントロールが可能になります。重要なのは、Moku:Pro のマルチ機器ツール機能により、妥協のないコンパクトなシステムで複雑なイメージング実験が可能になるということです。

図 7: マルチ楽器モードで使用中の Moku:Pro の画像。 In 1 と In 3 は、それぞれスロット 1 とスロット 2 の LIA の信号入力です。 2 は両方の LIA スロットのリファレンスです。示されている構成では、Out 1 と Out 3 はスロット 2 と 4 の記録された信号、Out 1 と Out 2 はダンプされた信号です。

参照：

1. フロイディガー、W.ミン、W。ザール、BG;ルー、Ｓ．ホルトム、GR;彼、C。ツァイ、JC;カン、JX。 Xie、XS、誘導ラ​​マン散乱顕微鏡による高感度のラベルフリー生物医学イメージング。 科学 2008、 322 （5909）、1857-1861。
2. ヒル、H。 Fu、D.、誘導ラマン散乱顕微鏡を使用した細胞イメージング。 アナル。 Chem。 2019、 91 （15）、9333-9342。
3. フィゲロア, ;胡、R.レイナー、シンガポール;鄭 Y. Fu、D.、誘導ラマン散乱によるリアルタイムマイクロスケール温度イメージング。 Journal of Physical Chemistry Letters 2020、 11 （17）、7083-7089。