受激拉曼散射显微镜

拉曼效应最早由 CV Raman 在 1920 年代发现^1，2. 它是一种广泛使用的光谱方法，用于确定分子的振动模式^3，4. 与其他分析化学方法相比，光谱方法提供高空间分辨率。 无需直接联系即可获取化学信息。 振动光谱提供合理的化学特异性，无需额外标记。 然而，自发拉曼效应是一个弱散射过程。 对于成像和显微镜应用，获取单个视场可能需要数小时的信号积分时间⁵。因此，受激拉曼散射效应等相干拉曼散射方法现在被广泛用于拉曼成像。在本应用笔记中，我们将描述如何 Moku:Lab 锁相放大器 在波士顿大学最先进的受激拉曼成像装置中实施。

受激拉曼散射显微镜简介

拉曼光谱 是一种非破坏性分析化学技术。它直接探测样品的振动模式。与电子光谱相比，拉曼光谱（包括受激拉曼光谱）无需荧光标记即可提供高化学特异性。可以以完全无接触和无标签的方式询问样品，从而防止对系统的干扰^6,7. 红外 (IR) 光谱是另一种常用的获取振动光谱的方法。 红外和拉曼光谱的选择规则不同； 红外光谱对偶极子的变化很敏感，而拉曼对极化率的变化很敏感⁴. 这使得 IR 和拉曼成为一组特定化学键的良好工具。 对于成像和显微镜应用，在 IR 或拉曼光谱之间进行选择时，还有两个其他重要因素需要考虑：1) 空间分辨率要求。 红外光谱使用红外光作为光源。 拉曼可以使用可见或近红外 (NIR) 激光进行激发。 由于可见或近红外激光的波长短得多，拉曼显微镜的空间分辨率可以达到亚微米范围。 另一方面，IR 光具有几微米的波长。 对于许多显微镜应用来说，空间分辨率被认为很差。 2) 水在红外区有很强的吸收。 对于富含水的环境（例如生物样品），IR 可能会受到强烈的背景吸收。 因此，在某些情况下，拉曼是优选的。

与主要的瑞利散射相比，拉曼散射非常弱。 通常需要几秒的长积分时间才能获得合理的信噪比。 这对于常规光谱可能不是问题，但对于光谱成像，可能需要几个小时才能获得单个视野。 为了增强信号，多年来开发了几种不同的方法。 基于等离子体的方法，如表面增强拉曼光谱，进一步将检测限降低到单分子水平⁸. 相反，纳米粒子引起的不均匀性使得成像变得困难。 对于成像科学家来说，更有前途的方法是非线性光学增强的相干拉曼散射方法：受激拉曼散射 (SRS) 和相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS)。

数字 1: Moku:Lab 的波形发生器生成的 10 MHz FM 信号

相干拉曼效应于 1960 年代首次被发现⁶. 在 1990 世纪 2000 年代后期和 XNUMX 年代，由于超快锁模激光器的进步，Sunney Xie 及其同事率先使用了 CARS⁹ 和SRS¹⁰ 用于无标记化学显微镜。 从那时起，这些技术被广泛应用于化学、生物学和材料科学研究^6,7,11。 CARS 和受激拉曼散射有很多相似之处；这些非线性光学过程通常发生在相同的条件下，并且仪器设置几乎相同。然而，也有一些差异；就像自发拉曼一样，CARS 信号（图 1，ω_as 反斯托克斯）与入射激光束（ω_p, 泵, ω_s 斯托克斯）。 使用短通滤波器很容易将信号与入射光分开。 到达检测器的光子总量很少，使用更灵敏的光子检测器，如光电倍增管 (PMT) 进行检测。 然而，CARS 受到其他非共振非线性光学效应产生的背景的影响。 这些影响不仅限制了 CARS 测量的实际检测极限，而且还扭曲了光谱（与分子振动共振相比）。 另一方面，SRS 信号不受大多数​​其他非线性光学效应的干扰。 然而，SRS 是一个受激发射过程。 信号出现在与入射光相同的波长处。 SRS 效应仅分别略微增加/减少斯托克斯和泵浦光束的光子数量。 这些变化非常小，无法通过常规时域测量方法进行测量。 因此，SRS 需要具有锁定检测的光学泵浦探测技术。

光泵浦探测技术和锁定检测

泵浦探针方法是受激拉曼散射显微镜中广泛采用的检测多光子过程的方法。该实验通常涉及两束超快（皮秒或飞秒）激光束。一束光束始终照亮样品，而第二束光束以恒定频率进行 AM 调制。因此，由第二光束引起的任何变化或扰动都会以调制频率转移到第一光束。在探测器上，光学滤波器用于阻挡调制光束。仅检测未调制的波长。由于信号仅出现在调制频率附近，因此通常使用锁定放大器 (LIA) 来放大信号。锁定放大器使用零差检测方法，将输入信号与调制频率的正弦本地振荡器混合。然后，它通过低通滤波器和电压放大器（可选）发送信号，并输出到数字化仪或示波器。这确保了只有非常接近调制频率的信号才会被放大和检测。其他频率（例如激光重复频率或直流背景）的信号将被拒绝。这使得锁相放大器成为泵浦探针检测的重要工具。有关锁定放大器的更详细说明可以在以下视频中找到： https://youtu.be/H2O2ADqEkHM 和 https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg.

特别是对于受激拉曼散射，两个光束（泵浦光束和斯托克斯光束）通过与感兴趣的拉曼位移精确匹配的能量差进行调谐。理论上，可以调制泵浦光束或斯托克斯光束，而另一光束用于检测。如果泵浦光束被调制，SRS 过程会在泵浦光束打开时引起斯托克斯光束的轻微增加。在检测器处，泵浦光束被阻挡，并且仅检测到斯托克斯光束。这称为受激拉曼增益 (SRG) 检测。如果斯托克斯光束被调制，SRS 过程会导致斯托克斯光束开启时泵浦光束略有下降。在检测器处，斯托克斯光束被阻挡，并且仅检测到泵浦光束。这称为受激拉曼损耗 (SRL) 检测。对于本应用笔记中介绍的示例用例，由于光电探测器针对泵浦波长进行了优化，因此实施了 SRL 方案。

图2： SRS 显微镜的 SRL 和 SRG 检测

使用 Moku:Lab 进行受激拉曼散射实验设置

激光打标系统

受激拉曼散射的产生需要两个超快激光脉冲在空间和时间上重叠在样品上。为了获得稳定的时间重叠，当今的 SRS 显微镜通常使用单个钛蓝宝石激光器来产生泵浦光束和斯托克斯光束。皮秒和飞秒激光器均可用于 SRS 测量。皮秒激光器提供更精细的光谱分布。无需额外的光学器件即可实现高光谱分辨率。与自发拉曼不同，自发拉曼可以用单色激光同时测量所有拉曼位移，受激拉曼需要调谐波长来测量额外的光谱点，而调谐激光波长会限制采集光谱图像时的测量速率。另一方面，飞秒激光器本身具有广谱。一种称为“光谱聚焦”的技术可用于快速调整泵浦和斯托克斯光束之间的能量差。可以在更短的时间内获取光谱图像。然而，这种方法也显着增加了系统的光学复杂性。光路中需要添加一对衍射光栅或高折射率材料（如SF57玻璃棒），光谱范围受到限制。关于光谱聚焦方法的详细解释可以在最近的出版物中找到¹².

简而言之，如果一次只对单个拉曼位移感兴趣，则皮秒激光器的设置要简单得多。 飞秒激光器是快速高光谱图像采集的首选，但代价是系统复杂性。 Moku:Lab LIA 可以与皮秒和飞秒激光器配对。 在本应用说明中介绍的用例中，飞秒激光器 (Spectra-physics Mai Tai) 与 SF57 玻璃棒一起用于光谱聚焦。

调制、延迟级和扫描头

泵浦和斯托克斯光束通常由声光调制器 (AOM) 或电光调制器 (EOM) 调制。 调制频率通常在 MHz 范围内。 这有助于减少光热膨胀产生的背景并提高图像采集速度。 在本应用说明中，泵浦光束由 AOM 在 2 MHz 左右进行调制。

为了在时间上对齐泵和 Stokes 光束，使用机动延迟级来调整一个或两个光束路径的路径长度。 对于具有光谱聚焦的飞秒 SRS，延迟级还用于微调泵浦和斯托克斯光束之间的能量差。

与大多数其他非线性光学显微镜一样，光束扫描方法通常用于 CARS 和 SRS 图像采集。 一对振镜或振镜共振扫描头放置在物镜之前。 在本案例中，使用了一对振镜（GVS 102，Thorlabs）。

物镜/聚光镜、检测器和数据采集

在扫描头之后，光束被引导至物镜，在样品上形成一个紧密聚焦的点。 高数值孔径 (NA) 水浸或油浸物镜是建立相干拉曼散射的相位匹配条件的首选。 然后在前向收集光并重新聚焦到光电探测器上。 为确保收集效率，建议使用油浸物镜。 在本案例中，使用了 60X 1.2 NA 水浸物镜（UPLSASP 60XW，奥林巴斯）。

一旦光被聚光器收集，它就会在滤光器之后重新聚焦到光电二极管上以阻挡调制光束。 来自光电二极管的信号随后被发送到锁定放大器（根据光电二极管配置，可能需要前置放大器/跨阻放大器）。 锁定放大器将信号与本地振荡器混合，并将调制频率的交流信号转换为直流输出。 然后将其发送到数据采集系统以形成图像。 在此应用中，Hamamatsu S3994-01 与自制跨导放大器配对，用于检测光学滤波器后的剩余光。 然后信号被发送到 Moku:Lab 的 LIA 进行交流信号放大和对话。 输入采用外部 (PLL) 模式解调。 7 微秒，2^nd 在混频器之后使用阶低通滤波器。 经过 10 dB 增益后，解调信号被发送到模拟输出。 LIA 的输出由 NI DAQ 系统数字化，图像由自制的 NI 虚拟仪器生成。

图3： 带 Moku:Lab LIA 的 SRS 显微镜

结果与讨论

为了测试 Moku:Lab LIA 性能，将一滴二甲基亚砜 (DMSO) 夹在两个盖玻片之间。然后通过受激拉曼散射显微镜对液滴的边缘进行成像。激光在扫描头之前使用 798 nm 泵浦 (30 mW) 和 1040 nm Stokes (150 mW) 进行调谐。在整个光谱范围内总共采集了 100 张图像。 LIA 的时间常数设置为 7 μs。图 4 显示了液滴边缘的 XY 剖面，右侧绘制了 Z 剖面（拉曼光谱）。可以清楚地观察到由CH键振动共振引起的两个主峰。

图4： DMSO 液滴的高光谱 SRS 图像

要访问图像的信噪比 (SNR)，最亮的图像（接近 2930 cm^-1） 用来。 SNR 是通过液滴区域中 10 x 10 框的平均强度超过背景区域中 10 x 10 框的标准偏差来计算的。 观察到 SNR 为 1100。

承认

我们要感谢波士顿大学的 Ji-Xin Cheng、Peng Lin 和 Haonan Lin 教授向我们提供了他们的实验细节、Moku:Lab 的使用说明和反馈。

参考资料

1. 拉曼，CV (1922)。 光的分子散射。 加尔各答大学。
2. 拉曼，CV (1928)。 一种新的辐射。
3. DA 龙 (1977)。 拉曼光谱。 纽约，1-12。
4. Colthup, N. (2012)。 介绍红外和拉曼光谱。 爱思唯尔。
5. Zhang, S., Song, Z., Godaliyadda, GDP, Ye, DH, Chowdhury, AU, Sengupta, A., … & Simpson, GJ (2018)。 共焦拉曼显微镜的动态稀疏采样。 分析化学90（7），4461 4469。
6. Prince, RC, Frontiera, RR 和 Potma, EO (2017)。 受激拉曼散射：从体积到纳米。 化学评论117（7），5070 5094。
7. Zhang, C., & Cheng, JX (2018)。 透视：相干拉曼散射显微镜，前途一片光明。 APL光电，3（9），090901。
8. Nie, S., & Emory, SR (1997)。 通过表面增强拉曼探测单分子和单纳米粒子 散射。 科学，275(5303)，1102-1106。
9. Zumbusch, A., Holtom, GR, & Xie, XS (1999)。 相干反斯托克斯拉曼散射的三维振动成像。 物理评论信，82（20），4142。
10. Freudiger, CW, Min, W., Saar, BG, Lu, S., Holtom, GR, He, C., … & Xie, XS (2008)。 通过受激拉曼散射显微镜进行高灵敏度的无标记生物医学成像。 科学322（5909），1857 1861。
11. Cheng, JX, & Xie, XS（编辑）。 (2016)。 相干拉曼散射显微镜。 CRC出版社。
12. Liao, CS, Huang, KC, Hong, W., Chen, AJ, Karanja, C., Wang, P., … & Cheng, JX (2016)。 通过微秒延迟线调谐受激拉曼光谱成像。 。光学3（12），1377 1380。

有疑问或想要可打印版本？

请与我们联系 support@liquidinstruments.com