誘導ラマン散乱顕微鏡法

誘導ラマン散乱顕微鏡用の Moku:Lab ロックインアンプの使用

2020 年 9 月 4 日

ラマン効果は 1920 年代に CV ラマンによって初めて発見されました。^1、2。分子の振動モードを決定するために広く使用されている分光法です^3、4。他の分析化学手法と比較して、分光学的アプローチは高い空間分解能を提供します。化学情報を得るために直接接触する必要はありません。振動スペクトルは、追加の標識を必要とせずに、合理的な化学的特異性を提供します。ただし、自発的なラマン効果は弱い散乱プロセスです。イメージングおよび顕微鏡アプリケーションの場合、単一の視野を取得するのに数時間の信号統合時間がかかる場合があります。⁵。したがって、誘導ラマン散乱効果などのコヒーレントラマン散乱法は、現在ラマンイメージングに広く使用されています。このアプリケーションノートでは、 Moku:Lab ロックインアンプボストン大学の最先端の誘導ラマンイメージング装置で実装されています。

誘導ラマン散乱顕微鏡の紹介

ラマン分光法は非破壊的な分析化学技術です。サンプルの振動モードを直接調査します。電子分光法と比較して、誘導ラマン分光法を含むラマン分光法は、蛍光標識を必要とせずに高い化学的特異性を提供します。サンプルは完全に非接触かつラベル不要の方法で検査できるため、システムの混乱を防ぐことができます。^6,7。赤外 (IR) 分光法は、振動スペクトルを取得するためによく使用されるもう 1 つの方法です。 IR 分光法とラマン分光法の選択ルールは異なります。 IR分光法は双極子の変化に敏感であり、ラマンは分極率の変化に敏感です。⁴。このため、IR とラマンは特定の化学結合のセットに適したツールになります。イメージングおよび顕微鏡アプリケーションの場合、IR 分光法またはラマン分光法を選択する際に考慮すべき重要な要素が他に 1 つあります。2) 空間分解能の要件。 IR分光法は光源としてIR光を使用します。ラマンは、可視または近赤外 (NIR) レーザーを励起に使用できます。可視レーザーまたは近赤外レーザーの波長ははるかに短いため、ラマン顕微鏡の空間分解能はサブミクロンの範囲に達します。一方、IR光は数ミクロンの波長を持っています。空間分解能は、多くの顕微鏡用途では低いと考えられています。 XNUMX) 水は赤外領域で強い吸収を示します。水分が豊富な環境 (生体サンプルなど) では、IR が強いバックグラウンド吸収を受ける可能性があります。したがって、場合によってはラマンが好まれます。

ラマン散乱は、支配的なレイリー散乱に比べて非常に弱いです。適切な信号対雑音比を得るには、通常、数秒という長い積分時間が必要です。これは通常の分光法では問題にならないかもしれませんが、分光イメージングの場合は 1 つの視野を取得するのに数時間かかる場合があります。信号を強化するために、長年にわたっていくつかの異なるアプローチが開発されてきました。表面増強ラマン分光法などのプラズモンベースの方法では、検出限界がさらに単一分子レベルまで低下します。⁸。対照的に、ナノ粒子の不均一性が誘発されると、イメージングが困難になります。イメージング科学者にとってより有望なアプローチは、非線形光学で強化されたコヒーレントラマン散乱法、つまり誘導ラマン散乱 (SRS) とコヒーレント反ストークスラマン散乱 (CARS) です。

フィギュア 1: Moku:Lab の波形ジェネレーターによって生成された 10 MHz の FM 信号

コヒーレントラマン効果は 1960 年代に初めて発見されました⁶。 1990 年代後半から 2000 年代にかけて、超高速モードロックレーザーの進歩のおかげで、Sunney Xie と同僚は CARS の使用の先駆者となりました。⁹ とSRS¹⁰ ラベルフリーの化学顕微鏡用。それ以来、これらの技術は化学、生物学、材料科学の研究で広く使用されています。^6,7,11。 CARS と誘導ラマン散乱には多くの類似点があります。これらの非線形光学プロセスは通常、同じ条件下で発生し、機器のセットアップもほぼ同一です。ただし、いくつかの違いがあります。自然発生ラマン、CARS シグナルと同様に (図 1、ω_asアンチストークス) は、入射レーザービーム (ω) とは異なる波長で発生します。_p、ポンプ、ω_s ストークス）。ショートパスフィルターを使用すると、信号を入射光から分離するのが簡単になります。検出器に到達する光子の総量は少量であるため、検出には光電子増倍管 (PMT) などのより感度の高い光子検出器が使用されます。ただし、CARS は、他の非共鳴非線形光学効果によって生成されるバックグラウンドの影響を受けます。これらの影響は、CARS 測定の実際の検出限界を制限するだけでなく、(分子振動共鳴と比較して) スペクトルを歪めます。一方、SRS 信号は、他のほとんどの非線形光学効果によって干渉されません。ただし、SRS は誘導放出プロセスです。信号は入射光と同じ波長で発生します。 SRS 効果は、ストークスビームとポンプビームの光子の数をそれぞれわずかに増加/減少させるだけです。変化は非常に小さいため、通常の時間領域の測定方法では測定できません。したがって、SRS にはロックイン検出を備えた光ポンプ・プローブ技術が必要です。

光ポンプ・プローブ技術とロックイン検出

ポンププローブ法は、誘導ラマン散乱顕微鏡で多光子過程を検出するために広く採用されている方法です。通常、実験には 2 つの超高速 (ピコ秒またはフェムト秒) レーザービームが使用されます。 1 つのビームは常にサンプルを照射し、2 番目のビームは一定の周波数で AM 変調されます。したがって、第 2 のビームによって引き起こされるあらゆる変化または摂動は、変調周波数で第 1 のビームに伝達されます。検出器では、変調されたビームをブロックするために光学フィルターが使用されます。変調されていない波長のみが検出されます。信号は変調周波数付近でのみ発生するため、信号の増幅には通常、ロックインアンプ (LIA) が使用されます。ロックインアンプはホモダイン検波方式を使用し、入力信号を変調周波数の正弦波局部発振器と混合します。次に、信号をローパスフィルターと電圧アンプ (オプション) に送信し、デジタイザーまたはオシロスコープに出力します。これにより、変調周波数に非常に近い信号のみが増幅および検出されることが保証されます。他の周波数の信号 (レーザー繰り返し周波数や DC バックグラウンドなど) は拒否されます。このため、ロックインアンプはポンププローブ検出に不可欠なツールになります。ロックインアンプの詳細な説明は、次のビデオでご覧いただけます。 https://youtu.be/H2O2ADqEkHM & https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg.

特に誘導ラマン散乱の場合、2 つのビーム (ポンプとストークス) は、目的のラマンシフトに正確に一致するエネルギー差で調整されます。理論的には、ポンプまたはストークスビームのいずれかを変調し、もう一方のビームを検出に使用できます。ポンプビームが変調されている場合、SRS プロセスにより、ポンプビームがオンの状態でストークスビームがわずかに増加します。検出器ではポンプビームが遮断され、ストークスビームのみが検出されます。これは、誘導ラマンゲイン (SRG) 検出と呼ばれます。ストークスビームが変調されている場合、SRS プロセスにより、ストークスビームがオンの状態でポンプビームがわずかに減少します。検出器ではストークスビームが遮断され、ポンプビームのみが検出されます。これは誘導ラマン損失 (SRL) 検出と呼ばれます。このアプリケーションノートで示されている使用例では、光検出器がポンプ波長に対して最適化されているため、SRL スキームが実装されています。

図2： SRS 顕微鏡用の SRL および SRG 検出

Moku:Lab を使用した誘導ラマン散乱実験のセットアップ

レーザ

誘導ラマン散乱の生成には、空間的および時間的にサンプル上で重なる 57 つの超高速レーザーパルスが必要です。安定した時間的オーバーラップを得るために、今日の SRS 顕微鏡は通常、単一の Ti:Sapphire レーザーを使用してポンプビームとストークスビームの両方を生成します。ピコ秒レーザーとフェムト秒レーザーの両方を SRS 測定に使用できます。ピコ秒レーザーは、より微細なスペクトルプロファイルを提供します。追加の光学部品を必要とせずに、高いスペクトル分解能を実現できます。すべてのラマンシフトを単色レーザーで同時に測定できる自然ラマンとは異なり、誘導ラマンでは追加のスペクトル点を測定するために波長調整が必要であり、レーザー波長を調整すると分光画像を取得する際の測定速度が制限されます。一方、フェムト秒レーザーは本来的に広いスペクトルを持っています。「スペクトル集束」と呼ばれる技術を使用すると、ポンプとストークスビーム間のエネルギー差を迅速に調整できます。分光画像ははるかに短い時間枠で取得できます。ただし、この方法ではシステムの光学的複雑さも大幅に増加します。一対の回折格子または高屈折率材料 (SFXNUMX ガラスロッドなど) をビーム経路に追加する必要があり、スペクトル範囲が制限されます。スペクトル集束方法の詳細な説明は、最近の出版物に記載されています。¹².

つまり、一度に 57 つのラマンシフトに興味がある場合、ピコ秒レーザーのセットアップははるかに簡単です。フェムト秒レーザーは、システムの複雑さを犠牲にして高速ハイパースペクトル画像取得に適しています。 Moku:Lab LIA は、ピコ秒レーザーとフェムト秒レーザーの両方と組み合わせることができます。このアプリケーションノートで紹介されている使用例では、スペクトルの集束のために、フェムト秒レーザー (Spectra-physics Mai Tai) が SFXNUMX ガラスロッドとともに使用されました。

変調、遅延ステージ、スキャンヘッド

ポンプおよびストークスビームは通常、音響光学変調器 (AOM) または電気光学変調器 (EOM) によって変調されます。変調周波数は通常、MHz の範囲にあります。これにより、光熱膨張によって生成される背景が軽減され、画像取得速度が向上します。このアプリケーションノートでは、ポンプビームは AOM によって約 2 MHz で変調されました。

ポンプとストークスビームを時間的に位置合わせするには、電動遅延ステージを使用してビーム経路の一方または両方の経路長を調整します。スペクトル集束を備えたフェムト秒 SRS の場合、遅延ステージはポンプとストークスビーム間のエネルギー差を微調整するためにも使用されます。

他のほとんどの非線形光学顕微鏡と同様に、CARS および SRS 画像取得にはビーム走査法が通常使用されます。一対のガルバノ-ガルバノまたはガルバノ-レゾナントスキャンヘッドが対物レンズの前に配置されます。この例では、一対のガルバノミラー (GVS 102、Thorlabs) が使用されました。

対物レンズ/コンデンサー、検出器、およびデータ収集

スキャンヘッドの後、ビームは対物レンズに向けられ、サンプル上にしっかりと焦点の合った点が形成されます。コヒーレントラマン散乱の位相整合条件を確立するには、高開口数（NA）の水浸または油浸対物レンズが好ましい。次に、光は前方に集められ、光検出器に再び焦点を合わせます。捕集効率を確保するには、油浸対物レンズを推奨します。提示されたケースでは、60X 1.2 NA 水浸対物レンズ (UPLSASP 60XW、オリンパス) が使用されました。

光がコンデンサーによって収集されると、変調ビームをブロックする光学フィルターを通過した後、フォトダイオード上に再焦点が合わせられます。フォトダイオードからの信号は、ロックインアンプに送信されます (フォトダイオードの構成によっては、プリアンプ/トランスインピーダンスアンプが必要になる場合があります)。ロックインアンプは信号を局部発振器と混合し、変調周波数の AC 信号を DC 出力に変換します。次に、データ収集システムに送信されて画像が形成されます。このアプリケーションでは、浜松ホトニクス製 S3994-01 と自作のトランスインピーダンスアンプを組み合わせて、光フィルター後の残留光を検出しました。その後、信号は Moku:Lab の LIA に送信され、AC 信号の増幅と会話が行われました。入力は外部 (PLL) モードで復調されました。 A 7μs、2^nd ミキサーの後にローパスフィルターを使用しました。復調された信号は、10 dB ゲイン後にアナログ出力に送信されました。 LIAからの出力はNI DAQシステムによってデジタル化され、画像は自作のNI仮想計測器によって生成されました。

図3： Moku:Lab LIA を搭載した SRS 顕微鏡

結果と考察

Moku:Lab LIA のパフォーマンスをテストするために、ジメチルスルホキシド (DMSO) の液滴を 798 枚のカバースリップの間に挟みました。次に、液滴の端を誘導ラマン散乱顕微鏡で画像化しました。レーザーは、スキャンヘッドの前で 30 nm ポンプ (1040 mW) および 150 nm ストークス (100 mW) で調整されました。スペクトル範囲全体にわたって合計 7 枚の画像が取得されました。 LIAの時定数は4μsに設定した。図 XNUMX は液滴エッジの XY プロファイルを示し、Z プロファイル (ラマンスペクトル) は右側にプロットされています。 CH 結合の振動共鳴によって誘起された XNUMX つの主要なピークが明確に観察できます。

図4： DMSO 液滴のハイパースペクトル SRS 画像

画像の信号対雑音比 (SNR) にアクセスするには、最も明るい画像 (2930 cm 付近)^-1）使用されている。 SNR は、バックグラウンド領域の 10 × 10 ボックスの標準偏差に対する液滴領域の 10 × 10 ボックスの平均強度によって計算されました。 1100 の SNR が観察されました。

謝辞

実験の詳細、Moku:Lab の使用方法の説明、フィードバックを提供してくださったボストン大学の Ji-Xin Cheng 教授、Peng Lin 教授、Haonan Lin 教授に感謝いたします。

参考文献

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